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常见ELISA试剂盒售后问题解答
信裕生物 / 2020-05-22

TOP1:标曲显色过强无明显梯度


1、主要怀疑点:洗板不充分:

1.1、机器洗版:确保机器设置的针头能吸干孔中液体,并且加液针头能加液大于350ul,加液针头没有被异物或者结晶盐堵住。

1.2、手动洗板,严格按照步骤,使用干净灭菌的枪头和加样槽,使用无氧化剂的吸水纸。加350ul洗液,静置90秒,在吸水纸上拍干孔中液体后再加入下一步洗液或者试剂。

1.3、特别注意,在加入TMB前的洗板步骤极其重要,残留的HRP酶会直接导致TMB显色。

2、次要怀疑点:

2.1、TMB 已经污染,检测TMB是否透明无色,如果偏蓝就是污染了。

2.2、检查配制洗液的水是否污染,要求使用的水是双蒸水,三蒸水或无离子水,水中的Fe3+,Cu3+,Co3+等过渡金属,以及HClO都会氧化TMB。

2.3、酶标板受潮,长霉,或者试剂过期。

2.4、环境污染,空气中有导致显色的物质或者粉尘。

Top2:显色较弱或不显色,没有说明书提供的数据阳性强


可能原因分析:

1、检查标准品是否受潮或者拿错

2、检查试剂是否按照说明书中要求的保存条件保存,特别是浓缩检测抗体和浓缩SABC, 如果放在-20度,融化后会严重影响其活性。

3、移液器是否校准,可以用去离子水较准移液器,1000ul=1.0g  100ul=0.1g  10ul=10mg

4、37度培养箱是否校准温度(建议用水银温度计放入水杯中,平衡12小时以上进行测量)。

5、SABC工作液和TMB在孵育前进行37度平衡半小时。

6、未严格按照说明书纸质版提供的方法操作。

7、试剂盒过期。

Top3:复孔做的不好,CV值差异大


可能原因分析:

1、复孔OD450数值在0.5-2.5之间计算的偏差相对较小,小于0.5会由于操作误差导致计算的CV值偏高,复孔样品数量在5-10个最佳。

2、操作时按照标准动作进行加样,比如要求枪头不能碰触到孔壁内侧和底面,枪头尖部的残留液体可以触碰到液面,使之流入样品孔。

3、加样尽量快速准确,不要产生气泡。

4、样品需要做预实验,使用不同浓度进行测试,找到最佳稀释比。错误的稀释比会导致复孔误差大

Top4:显色太快,背景小于0.2,但是样品没有阳性。试剂盒工作正常,但是样品没有阳性。


可能原因分析:

1、样品是否保存妥当。蛋白容易降解,最好保存在-80℃,或者新鲜样品立即检测。

2、样品含有的基质影响抗原抗体结合,导致没有阳性。需要适当稀释样品 1/5,1/10,1/100,1/1000来摸索最佳检测稀释比,稀释液稀释样品后会消弱基质效应,阳性就会升高。

3、部分试剂盒要求4度过夜孵育样品和标准品,如果样品稀释后还是检测不到阳性,建议4度16小时孵育标准品和样品,其它步骤在按照说明书提供的温度和时间进行操作。

4、如果是特殊的样品,请通过邮件与我们技术支持进行联系。


TOP5:稀释过的样本OD 值比没有稀释的样本值高些


1、血清有基质效应,会导致试剂盒回收率下降。所以用原液检测数值会低于稀释后的数据。

2、ELISA试剂盒提供的稀释液有抗基质成分,说明书要求样品至少稀释1倍以上

3、血清的基质的一类异嗜性抗体或者溶血后的物质,这些物质会封闭捕获抗体,导致抗体无法结合样品中的蛋白,当稀释后 这类物质效应下降,回收率就升高。


Top6:标曲方程选择问题


一般我们选择曲线平滑上升或者下降,所有点都在曲线上,R值接近于1的方程
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