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细胞培养被支原体污染是极普遍的问题，面对支原体污染给细胞培养带来的巨大难题，世界各国开始重视，并相继建立了细胞库，对细胞质量进展控制，效果显著，支原体污染的问题得以限制。目前已知能污染细胞的支原体有20多种以上，其中95％以上的支原体污染是口腔支原体。
支原体在自然界分布广泛，无细胞壁，直径为0.1-0.3μm，且形态易变，极易通过除菌过滤器。大部分支原体繁殖速度比细菌慢，适宜生长温度为35℃，适合于偏碱条件下生存（pH7.6—8.0），对酸耐受性差，对75%乙醇、煤酚皂溶液敏感。对热比较敏感在细胞培养过程中如果在显微镜下发现破碎的细胞很多，需要频繁换液才能维持传代培养的时候，即应怀疑支原体污染。细胞培养过程中遇到的支原体95%都来自于以下四种支原体：口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、莱氏无胆甾支原体，其中莱氏无胆甾支原体为牛源性。
1. 精氨酸肉汤培养基 按说明称量粉剂，蒸馏水配制， 高压除菌（加20％胎牛血清）。
2. 支原体琼脂培养基 按说明称量粉剂，蒸馏水配制，高压除菌（加20％胎牛血清）。
3. 其他 超净工作台、无菌吸管、试管架、培养试管／皿、37°C 培养箱。
（二）操作步骤
1. 样品的储存。样品取材后，最好尽快进行检测。样品如在24h 以内进行支原体检测， 可储存在2~8℃; 如果超过24h 样品应放置于－20℃ 以下保存。-20℃保存的样品，进行检测时需重新加入到对照培养细胞中，培养72h 后，取上清直接进行接种检测。
2. 准备精氨酸肉汤培养基、支原体琼脂培养基（半流体）。
3. 将样品分别接种到10ml 精氨酸肉汤培养基、半流体培养基中（已冷却至36℃） ，每支培养基接种样品0.5~ 1.0ml. 每种样品接种6 支精氨酸肉汤培养基，3 支半流体培养基。
4. 接种6d 后，取3 支精氨酸肉汤培养基中样品0.5 ~ 1.0ml. 复种于精氨酸肉汤培养基中。
5. 36 ℃ 培养29d, 每隔3d 观察一次。记录实验结果。
（三）结果判断
培养结束时，精氨酸肉汤培养基如有支原体生长，则液体颜色改变（粉色或黄色) 。
半流体培养基中如有支原体生长，则出现絮状沉淀
（二）操作步骤
（三）注意事项
该实验具有灵敏度高、特异性强、快速的特点，但其对实验环境的要求严格，实验成本较高，有时还有假阳性的现象出现。
PCR 法检测支原体污染的基本原理是酶促 DNA 合成反应，即在 DNA 模板、引物和脱氧核糖核酸存在下，经 DNA 聚合酶的作用，使 DNA 链扩增延伸。
1. 支原体检测试剂盒（内有引物、阳性对照、内对照、StrataClean 树脂、缓冲液；）
（二）操作步骤
待测细胞用无双抗培养基培养 7 d，用无菌容器取上清液 500 μl，4 ℃ 保存待测。
在无菌的条件下，取细胞培养上清液 100 μl 于一无菌的 0.5 ml 塑料离心管内，盖好盖子，95 ℃ 水浴加热 5 min。
H. PCR 程序：
| 程序 | 循环数/次 | 温度/℃ | 时间/min | 程序 | 循环数/次 | 温度/℃ | 时间/min |
| 1 | 1 | 94 | 2 | 2 | 40 | 94 | 1 |
| 50 | 2 | 50 | 1 | ||||
| 72 | 2 | 72 | 2 | ||||
（三）注意事项
（一）原理
利用电子显微镜的超级放大功能， 直接观察培养细胞中支原体污染情况。
（二）材料与设备
待检测细胞， 0.05％胰蛋白酶／0.02%EDTA 、2.5％的戊二酸、1％锇酸、0.1mol/L磷酸缓冲溶液（ pH7.4 ) ，扫描电镜及相关设备。
（ 三）操作步骤
1. 将待检测细胞传代至贴有盖玻片的培养皿中。
2. 37°C , CO2 培养箱中培养24h , 取出盖玻片。
3. 以PBS 洗涤3 次。
4 . 以2 .5％戊二醛/PBS 固定15min , PBS 洗涤。
5 ．以1％锇酸固定30min, PBS 洗涤。
6 . 乙酸异戊酯脱水。
7. CO2 冰点干燥。
8. 喷金。
9 . 扫描电镜观察，照相。
（四）结果分析
以上就是小编整理的四种支原体检测方法，希望对大家细胞培养能有所帮助。一般来说每1至3个月就应该进行一次支原体检测。将定期支原体检测常规化坚持下去，是细胞培养实验室应对支原体感染的关键。同时预防支原体的污染也很关键。这期内容就到这里结束啦！