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酿酒酵母Y2HGold化学感受态细胞 XY91148CC

Saccharomyces cerevisiae cells Y2HGold chemistry

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酿酒酵母Y2HGold化学感受态细胞

产品及特点

酿酒酵母 Y2HGold 是公司开发的 GAL4 系统酵母双杂实验用菌株,MATa 型,可直接转化质粒或与 MATα 型酵母菌株 Y187 通过 mating 操作进行蛋白互作验证或筛 库试验。Transformation marker 为:trp1,leu2,报告基因为:AbAr,HIS3,ADE2,MEL1。 Y2HGold-GAL4 酵母双杂系统需要两种质粒配套使用:pGBKT7 和 pGADT7。质粒 pGBKT7 的筛选标志为 TRP1,用于表达 DNA-BD (来自酵母转录因子 GAL4N 端 1~174 位 氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白;质粒 pGADT7 的筛选标志为 LEU,用于表达 AD(GAL4 C 端 768 ~881 位氨基酸)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。 GAL4 系统原理:一个完整的酵母转录因子GAL4可分为功能上相互独立的两个结构 域:位于N端1~174位氨基酸区段的DNA结合域(DNA-BD)和位于C端768~881 位氨基酸 区段的转录激活域(AD)。DNA-BD能够识别GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS, 并与之结合。而AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD单独存在不能激活转录, 但当二者接近时,则呈现完整的GAL4活性,使含有UAS的启动子下游基因转录表达。正常 条件下,BD不与AD结合,将要检测的蛋白质分别与BD和AD融合,形成bait融合蛋白(bait -BD)和prey融合蛋白(prey-AD),如果bait和prey发生相互作用,就会促使BD和AD的相 互接近,形成完整的GAL4,从而激活报告基因的转录。Y2HGold有四个报告基因:AbAr, HIS3,ADE2,MEL1,分别由三种不同的启动子(G1,G2,M1)启动,这三种启动子只 有GAL4识别的17 bp核心区相同,其余部分均不同,大大降低了酵母双杂假阳性发生的概 率。此外新报告基因AbAr与以前的营养缺陷报告基因相比具有更低背景的优点,也可以降 低酵母双杂假阳性发生的概率。 

Y2HGold感受态细胞经特殊工艺制作,-80℃可保存三个月,pGADT7质粒检测转化 效率>104cfu/μg DNA。 

Y2Hgold的基因型是:

MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ, LYS2::GAL1UAS-Gal1TATA-His3, GAL2UAS-Gal2TATA-Ade2 URA3::MEL1UAS-Mel1TATA AUR1-C MEL1

规格及成分

运输及保存 感受态细胞干冰运输、-80℃保存,Carrier DNA -20℃保存;PEG/LiAc 4℃保存;有效 期半年。 自备试剂 目的 DNA、YPDA、 SD 培养基等

使用方法

1. 取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为 50-100 μL,可以根据 实际情况分装使用。 以下实验以 100 μL 感受态细胞为例。

2. 待感受态细胞融化后,向感受态细胞悬液中依次加入 2-5 μg 预冷的目的质粒、10μL Carrier DNA(95-100℃ 5 分钟,快速冰浴,重复一次)、500 μL PEG/LiAc, 吹打混匀,30℃水浴 30 分钟(15 分钟时翻转 6-8 次混匀)。

3. 42℃水浴 15 分钟(7.5 分钟时翻转 6-8 次混匀)。

4. 5000 rpm 离心 40 秒,弃上清。取 400 μL ddH2O 重悬沉淀,5000 rpm 离心 30 秒,弃上清。

5. 取 50 μL ddH2O 重悬沉淀,涂板,29℃培养 48-96 小时。

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