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GS AntiQ qPCR SYBR Green Master Mix XY9A2465

抗体修饰热启动酶 ,高灵敏度,包含高低ROX,适用于所有机型

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GS AntiQ qPCR SYBR Green Master Mix

产品组成

组分规格
2×GS AntiQ qPCR SYBR Master Mix5×1.0 mL
ROX Reference Dye I (High)200 µL
ROX Reference Dye II (Low)200 µL

保存条件

-20℃保存 12 个月。

产品简介

本产品是采用 SYBR Green I 嵌合荧光法进行 qPCR 反应的专用试剂。产品中包含抗体修饰的新型热启动 GS AntiQ DNA polymerase 和精心优化的 Buffer,能有效抑制低温下的非特异性扩增,大大提高了反应特异性和扩增效率,能够在更宽广的范围内进行准确定量。此外,本产品根据不同的仪器型号配有两种 ROX Reference Dye(High/Low),用来校正仪器孔间的荧光误差。

产品特点

高特异性:采用抗体修饰的新型热启动 GS AntiQ DNA polymerase 和精心优化的 Buffer;

操作简便:2×预混液中包含有 qPCR 反应所需所有组分,只需加入模板、引物、ROX Reference Dye 和水即可进行反应。

适用范围及适用机型

本产品适用于试剂盒提取的基因组 DNA、cDNA、质粒 DNA 和λDNA 等样本的扩增定量。

常见仪器所需 ROX 参考:

2022110805523549420

注意事项

1. 使用前请充分溶解混匀,尽量避免反复冻融,以免酶活下降;

2. 本产品中含有 SYBR Green I,需避光保存,使用时尽量避免强光照射;

3. 为了避免气溶胶污染,建议使用核酸清洁剂对实验台面及操作环境进行清洁;

4. 为不影响后续实验,建议做预实验检查引物有效性和特异性;

5. 上机前,注意消除体系中的气泡,以免对结果造成影响。

使用方法

操作示例

按下表配制 PCR 反应体系(冰上操作)

2022110805572933262

a. 引物终浓度推荐 0.4 µM,当反应性能较差时,可在终浓度 0.2~1.0 µM 范围内调整引物浓度。推荐引物长度 25 bp 左右、Tm 值 60℃~65℃为佳,GC 含量控制在 50%左右、3’端最后一个碱基最好为 G 或 C,比对引物避免 3’端或引物间有非特异性互补;

b. 为保证扩增效率,建议将模板适当稀释后再进行 qPCR 反应。若模板为 cDNA 原液,则使用体积不超过 qPCR 反应总体积的 1/10,即 2 μL/20 μL 体系。

推荐的 qPCR 程序

两步法扩增程序

2022110805581364081

三步法扩增程序(当模板浓度低或 qPCR 扩增效率低时可尝试)

2022110805583438739

注:熔解曲线使用仪器默认程序即可。

结果分析

1. NTC(No Template Control,无模板阴性对照):若 NTC 的 CT 值大于 35 或无 CT,则体系不存在污染;若 CT 值小于 35,则体系可能存在污染或引物不特异,形成引物二聚体,建议清洁实验环境、更换无菌水、检查引物是否污染,或适当降低引物浓度、优化引物设计。

2. 扩增曲线及 CT 值:标准扩增曲线呈光滑的“S”型。一般情况下目的基因 Ct 值在 20~30 之间,内参 Ct 值在 15~20 之间。若 Ct 值较小,建议稀释模板;若 Ct 值较大,建议提高模板浓度或增大反应体系;若 Ct 值大于 35,检测结果无法定量分析基因的表达量,但可用于定性分析。 

3. 熔解曲线:标准熔解曲线呈单峰。若熔解曲线出现双峰或者多峰,可能存在污染、引物二聚体或非特异扩增,建议降低引物浓度或优化引物设计。

常见问题与解决办法

Q1:无 Ct 值出现?

A1:

1) 采集荧光信号的步骤有误。检查程序设置,两步法扩增在退火延伸步骤采集信号,三步法扩增在延伸阶段采集信号;

2) 模板或 ROX 使用错误。当 ROX 浓度太低或太高时,Ct 值可能显示为 Unknown 或空白,根据仪器类型选择合适的 ROX;

3) 引物或模板降解。PAGE 电泳检测引物完整性,琼脂糖凝胶电泳检测模板 DNA 或 RNA 的质量及完整性,RNA 模板建议重新逆转录获得 cDNA,cDNA 应尽快使用;

4) 模板量不足。适当增加模板用量或重新制备高浓度模板。

Q2:实验重复性差?

A2:

1) 加样存在误差。使用性能较好的移液枪,配制预混液后分装,减少移液误差;

2) 荧光定量 PCR 仪器不同位置温度控制不一致。定期校准仪器;

3) 模板浓度低或拷贝数低。适当增加模板用量。

Q3:扩增曲线形状异常?

A3:

1) 扩增曲线不光滑。信号太弱,经系统矫正后产生,可提高模板浓度重复实验;

2) 扩增曲线断裂、骤降。模板浓度较高或反应管内留有气泡,减小基线终点(CT 值-4)重新分析数据,或上机前离心并仔细检查反应管内是否有气泡残留;

3) 分析数据时通道选择不正确。如没有在体系中加入 ROX,但分析时在仪器设置中选择了 ROX 选,应根据具体操作体系选择合适的分析条件。

Q4:同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线?

A4:

分析扩增效率,灵敏度,特异性,如果扩增效率在 90%~110%,且都是特异性扩增,则数据均可分析使用。

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