人 CD3+细胞分离试剂盒使用说明书

（正选）

【产品名称】

中文名称：人CD3+细胞分离试剂盒(正)

英文名称：Human CD3+ cell isolation kit（positive selection）

【编号】

XY9CM007K

【细胞处理量】

用于处理 1×10⁹ 个细胞

【分选方法】

正选

【试剂盒组成】

【预期用途】

适用于从人外周血、浓缩白细胞来源的单个核细胞中正选出 CD3+细胞。

【贮藏条件与有效期】

生物素化人 CD3 抗体，链霉亲和素磁珠及细胞分选缓冲液均置于 2-8°C 保存，有效期为 12 个月；生产日期，有效期至：见标签。

【产品简介】

CD3 在所有 T 细胞和 NKT 细胞上表达，是 T 淋巴细胞表面最具特征性的“身份标识”之一，作为 T 细胞受体（TCR）复合物的核心组成部分，它就像 T 细胞的“信号传递中枢” ，在 T 细胞识

别抗原、传递免疫信号以及启动免疫活化的过程中，发挥着关键作用。

CD3 抗原包括一条 CD3γ链、一条 CD3δ链和两条 CD3ε链，这些链与 T 细胞受体（TCR）（可与αβTCR 或γδTCR 结合）和 CD3-zeta  (ζ链）结合，形成完整的 TCR-CD3 复合物。每个 CD3 分子都会形成两对二聚体（常见组合为γε 、δε 、ζζ) 。其中，CD3ε 、CD3δ 、CD3γ这三种肽链有部分结构暴露在细胞外（胞外区），而且每一对胞外二聚体中，都必然包含一个 CD3ε肽链；而 CD3ζ肽链则几乎全部位于细胞内（胞内区），主要负责信号的最终传递。

本产品能够从新鲜或冻存的外周血单个核细胞中简便快捷的分选出高纯度的 CD3+细胞，能够处理的总细胞量为 1×10⁹ ，可为基础和临床研究使用 CD3+细胞提供一个有力的工具。

【操作步骤】

一、 单个核细胞的提取（以50mL 外周血为例）

1.取 50ml 外周血，若需要提取血浆，则取血浆提取后的下层红色细胞沉淀，加入生理盐水或 PBS至原体积；

2.取 2 支 50mL 离心管，分别加入 15mL  淋巴细胞分离液，并将 1 步骤中的血样分别缓缓铺加到淋巴细胞分离液的上层；

注意：铺加血样时建议速度适中，尤其是刚开始的铺加，避免破坏淋巴细胞分离液与血样的界面。

3.室温下，800g  离心 20min（无闸减速）；

4.离心后，离心管中样品由上到下分为 4  层：血浆层-白膜层-人淋巴细胞分离液层-红细胞与粒细胞的沉淀。分别小心吸取白膜层及其以下约一半的液体于新的离心管中，并加入生理盐水或 PBS至 40mL 体积，混匀，300g 离心 10min；

5.弃上清，沉淀再次用 40mL 的生理盐水或 PBS 重悬，300g 离心 10min；

6.弃上清，沉淀即为 PBMC ，备用。

二、 人 CD3+细胞分离

图 1. FLOSEP  细胞分离示意图

注意：细胞分离过程中抗体孵育、洗涤和磁珠的孵育在离心管操作即可，磁吸和洗涤则转移至流式管中操作。

1、调整细胞密度：将欲操作的 PBMC 细胞浓度调整为 1×108 cells/mL；

注意：

1）若 PBMC 为冻存细胞，可直接用预冷的细胞分选缓冲液复苏洗涤；若 PBMC 为新鲜提取的细胞，则可在 PBMC 提取的最后一步洗涤操作中用细胞分选缓冲液洗涤；

2）若所要分离的细胞数量过少，例如只有 1×10⁷ cells，则可将细胞密度调整为 5×10⁷ cells/mL，用于分离的细胞不建议低于 1×10⁶ cells ，重悬体积不低于 50μL。

2 生物素化抗体孵育：将 CD3 生物素化抗体以 200μL 抗体/1×108 初始 PBMC 的比例将加入细胞悬液中，迅速用移液枪轻柔吹打，充分混合后置于 4°C 孵育 5min；

3 洗涤：孵育完毕后，加入 10 倍体积细胞分选缓冲液，4°C  ，300g 离心 5min 后，弃上清，加入一定量的细胞分选缓冲液，使细胞悬液体积回复到初始；

注意：采用倾倒法移除上清时，管口处会残留些许缓冲液，尽可能将这些残留液用移液枪吸取干净，必要时可再次用缓冲液洗涤，避免残留液中的过量抗体干扰后续磁珠的结合。

4 磁珠孵育：将细胞悬液转移至流式管， 以 100uL 磁珠/1×10⁸ 初始 PBMC 的比例，将链霉亲和素磁珠加入到 PBMC 中，迅速用移液枪轻柔吹打均匀，4°C 孵育 1~3min；

注意：磁珠吸取前需将磁珠溶液充分振荡或吹吸均匀。

5 磁吸：孵育完毕后，加入分选缓冲液至 2.5mL，轻柔吹打均匀，将流式管置于磁极中，磁吸 3min，手握磁极倾倒液体，收集倾倒出的液体，即为不含 CD3+细胞的细胞悬液；

注意：倾倒液体时，速度不可过快，避免造成过快的液体流速冲刷出已磁吸在管壁的细胞。

6 再次磁吸：取出流式管，加入与步骤 5 同体积的细胞分选缓冲液，轻柔吹散磁珠后再次磁吸 3min，收集未磁吸的细胞，并与步骤 5 的细胞悬液合并。

7 所得磁吸细胞即为 CD3+细胞

注意：

1）若实验目的为获得非 CD3+细胞，则需要合并多次磁吸洗涤过程中的非磁吸细胞。

2）可将合并的细胞悬液重复磁吸， 以充分收集悬液中残留的带磁珠 CD3+细胞。

【纯度检测】

可用抗人 CD3 流式抗体(克隆号 HIT3a或者 SK7)进行纯度与得率的鉴定。

【产品性能指标】

产品性能符合本企业制定的产品技术要求。

仅用于科研，不能用于临床诊断！所有产品仅供科研使用，不得用于人或动物的治疗等任何其他用途，不为任何个人提供产品和服务。